طراحی هدایت خنثی سازی تریمرهای پاکت HIV-1 با تمایل زیاد برای لنگر مشترک متداول نشده CD4bs-linea CH235 به طور گسترده آنتی بادی های خنثی


Translating…

  • Loading metrics

Open Access

Peer-reviewed

Research Article

Abstract

The CD4 binding site (CD4bs) of the HIV-1 envelope glycoprotein is susceptible to multiple lineages of broadly neutralizing antibodies (bnAbs) that are attractive to elicit with vaccines. The CH235 lineage (VH1-46) of CD4bs bnAbs is particularly attractive because the most mature members neutralize 90% of circulating strains, do not possess long HCDR3 regions, and do not contain insertions and deletions that may be difficult to induce. We used virus neutralization to measure the interaction of CH235 unmutated common ancestor (CH235 UCA) with functional Env trimers on infectious virions to guide immunogen design for this bnAb lineage. Two Env mutations were identified, one in loop D (N279K) and another in V5 (G458Y), that acted synergistically to render autologous CH505 transmitted/founder virus susceptible to neutralization by CH235 UCA. Man5-enriched N-glycans provided additional synergy for neutralization. CH235 UCA bound with nanomolar affinity to corresponding soluble native-like Env trimers as candidate immunogens. A cryo-EM structure of CH235 UCA bound to Man5-enriched CH505.N279K.G458Y.SOSIP.664 revealed interactions of the antibody light chain complementarity determining region 3 (CDR L3) with the engineered Env loops D and V5. These results demonstrate that virus neutralization can directly inform vaccine design and suggest a germline targeting and reverse engineering strategy to initiate and mature the CH235 bnAb lineage.

Author summary

Despite a wealth of information on the epitopes, ontogeny, structure and maturation pathways of multiple epitope classes of HIV-1 broadly neutralizing antibodies (bnAbs), there has been little progress eliciting similar antibodies by vaccination. One major contributing factor is the failure of many candidate immunogens to engage germline reverted forms of bnAbs, making it unlikely that they will provide adequate stimulation of appropriate naïve B cells to initiate bnAb lineages. Here we used virus neutralization to identify two point mutations and a modified glycan profile that together render HIV-1 CH505 Env-pseudotyped virus highly susceptible to neutralization by a germline-reverted form of the CH235 lineage of CD4 binding site (CD4bs) bnAbs. These same modifications permit strong binding of corresponding soluble native-like CH505 Env trimers to germline-reverted CH235. These observations provide a conceptual framework for the design and testing of novel immunogens that aim to elicit the CH235 bnAb lineage.

Citation: LaBranche CC, Henderson R, Hsu A, Behrens S, Chen X, Zhou T, et al. (2019) Neutralization-guided design of HIV-1 envelope trimers with high affinity for the unmutated common ancestor of CH235 lineage CD4bs broadly neutralizing antibodies. PLoS Pathog 15(9): e1008026. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026

Editor: David T. Evans, University of Wisconsin, UNITED STATES

Received: June 19, 2019; Accepted: August 12, 2019; Published: September 17, 2019

This is an open access article, free of all copyright, and may be freely reproduced, distributed, transmitted, modified, built upon, or otherwise used by anyone for any lawful purpose. The work is made available under the Creative Commons CC0 public domain dedication.

Data Availability: All relevant data are within the manuscript and its Supporting Information files.

Funding: This work was funded by the Bill & Melinda Gates Foundation (Collaboration for AIDS Vaccine Discovery, grant no. 1032144 to DCM) and by the Intramural Research Program of the Vaccine Research Center, NIAID, NIH. This work was further supported by extramural grants from the NIH (Center for HIV/AIDS Vaccine Immunology Immunogen Design, U01 AI100645 to BFH; 5R01 AI145687 to PA). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing interests: The authors have declared that no competing interests exist.

Introduction

The trimeric HIV-1 envelope glycoprotein (Env) spikes that mediate virus entry into cells are vulnerable to at least six distinct epitope classes of broadly neutralizing antibodies (bnAbs), where each bnAb class is a major focus for vaccine design [1]. These bnAbs arise during chronic HIV-1 infection and target epitopes in the CD4 binding site (CD4bs), V2-apex and V3-glycan regions of gp120, the membrane-proximal external region (MPER) of gp41, the gp120-gp41 interface/gp41 fusion peptide, and glycan-dependent epitopes in the center of the gp120 “silent face” [2]. Efforts to elicit HIV-1 bnAbs by vaccination face unusual challenges, due in part to the glycan shielding and conformational masking mechanisms the virus uses to evade antibody recognition [3, 4]. Other challenges include proper engagement of the correct precursor B cells that give rise to bnAbs [5, 6], overcoming host tolerance controls of bnAb development [7, 8, 9], and an ability to drive high levels of somatic hypermutation that are often required for bnAb activity [10, 11]. While there has been modest success inducing bnAb-like activity in animal models [12, 13, 14, 15], much stronger and broader neutralization will be needed to provide adequate protection in humans.

New information is constantly emerging on the structures of bnAbs and their epitopes, as well as maturation pathways that give rise to bnAbs in HIV-1-infected people [16]. This information is useful for engineering novel immunogens with a focus on inducing either specific bnAb lineages, or general epitope classes of bnAbs [17]. The design and selection of candidate immunogens is often guided in part by measures of binding to one or more germline-reverted, intermediate or mature forms of bnAbs as indicators of epitope integrity [18, 19, 20]. Much attention focuses on immunogens that preserve and stabilize native Env trimer structure to favor correct antibody maturation while minimizing off-target antibody responses [21]. Considerable progress has been made in designing and producing stabilized, soluble native-like trimers as candidate immunogens [22, 23, 24, 25, 26, 27]. Unlike these stabilized trimers, unliganded native trimers on the virus surface are structurally dynamic, spontaneously transitioning through at least three conformational states [28]. It is not yet clear how these dynamic properties will impact the conformation(s) needed for desired immunogenicity.

We recently used Env-pseudotyped virus neutralization to guide the design of germline-targeting immunogens for VRC01-class bnAbs [29]. Neutralization by germline-reverted VRC01 (VRC01gl) was used to predict precursor B cell receptor engagement by functional Env trimers on HIV-1 strain 426c. Neutralization by VRC01gl required targeted deletion of one or more N-glycans bordering the CD4bs, combined with Man5-enrichment of remaining N-glycans that are otherwise processed into larger complex-type glycans. These changes aimed to facilitate VRC01gl binding by increasing exposure of the CD4bs while having minimal impact on overall native Env trimer structure. While this approach worked for germline-reverted forms of several VRC01-class bnAbs, it was not successful for germline-reverted forms of other CD4bs bnAbs.

Here we have explored a similar approach by using autologous virus neutralization to guide the design of immunogens aiming to elicit the CH103 and CH235 lineages of CD4bs bnAbs. These two lineages co-evolved in a clade C HIV-1 infected individual (CH505) in Africa who was longitudinally sampled from acute infection for a period of 6 years [30]. CH103 utilizes VH4-59 and matured to neutralize 55% of a multi-clade panel of 196 Env-pseudotyped viruses [30]. CH235 and its more mature lineage member, CH235.12, utilize VH1-46, neutralize 18% and 90%, respectively, of a multi-clade panel of 199 Env-pseudotyped viruses, and do not require insertions or deletions for this neutralizing activity [31, 32]. The inferred unmutated common ancestor (UCA) of the CH235/CH235.12 lineage, referred to here as CH235 UCA2, exhibits micromolar affinity binding and weak neutralizing activity against an early autologous CH505 Env that differs from the transmitted-founder (TF) Env by a single N279K change, suggesting that this variant (also called M5) initiated the lineage [31].

We describe a discrete set of synergistic Env modification that render autologous CH505TF Env-pseudotyped virus highly susceptible to neutralization by CH235 UCA2 in a stepwise manner. Moreover, neutralization potency against engineered Env-pseudotyped viruses correlated with binding affinity to corresponding soluble native-like Env trimers as candidate immunogens.

Results

Targeted glycan deletion and Man5-enrichment

We sought to identify Env modifications that would render CH505TF Env susceptible to neutralization by the UCAs and intermediates of the CD4bs bnAbs CH103 and CH235. We began by testing autologous CH505TF Env-pseudotyped viruses that lacked select glycans bordering the CD4bs. One variant lacked four glycans at N197, N461/462, N276 and N362 (gly4), whereas the others lacked three glycans by adding back either N197 (gly3.197), N276 (gly3.276) or N461 (gly3.461) [33]. As reported previously [33], glycan-deleted CH505TF was highly sensitive to neutralization by mature CD4bs bnAbs, while glycan deletion had little impact on most other mature bnAbs (Fig 1).

thumbnail

Fig 1. Neutralization phenotype of parental and mutants of CH505TF produced in 293T and 293S GnT1 cells.

Neutralization tier phenotypes were characterized with pooled serum samples from 5 HIV-1 infected individuals (CHAVI samples). Additional neutralization phenotyping was performed with monoclonal antibodies. 1CH505TF.gly4 (197, 461/462, 276, 362); CH505TF.gly3.197 (461/462, 276, 362); CH505TF.gly3.276 (197, 461/462, 362); CH505TF.gly3.461 (197, 276, 362). 2GMT, geometric mean titer. 3Tier classification: Tier 1A (ID50 >2000), Tier 1B (ID50 350–2000), Tier 2 (ID50 50–349), Tier 3 (ID50 S1A–S1K Fig.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.g001

A notable exception was that all Man5-enriched viruses exhibited increased resistance to PGT151, which agrees with the known dependency of this interface bnAb on complex-type glycans [34, 35]. Also as reported previously [33], the gly4, gly3.276 and gly3.461 variants were 136–950 times more sensitive to mature CH103, and 3.5–40 times more sensitive to mature CH235 and CH235.12 than parental CH505TF (Fig 1). In addition, we found that gly4, gly3.276 and gly3.461 were substantially more sensitive to intermediates of CH103 but not intermediates of CH235 (Fig 1). Notably, glycan deletion alone was not sufficient for neutralization by the UCAs of either bnAb lineage (Fig 1).

Our previous work showed that neutralization of 426c by germline-reverted VRC01 required both targeted glycan deletion and Man5-enrichment [29]; therefore, we sought to determine whether Man5-enrichment of glycan-deleted CH505TF would enable neutralization by the UCAs of CH103 and CH235/CH235.12. Parental and glycan-deleted CH505TF Env-pseudoviruses were produced in 293S/GnT1 cells to enrich for Man5GlcNAc2 (Man5) glycoforms of N-linked glycans that are otherwise processed into larger complex-type glycans. These cells lack the enzyme N-acetylglucosaminyltransferase 1 (GnT1) that is responsible for attachment of GlcNAc to Man5GlcNAc2 in the medial-Golgi as a requisite step for complete processing [36]. Man5-enrichment has potential to reduce steric barriers to germline bnAb binding without disrupting native Env conformation [29, 37, 38]. GnT1 versions of the CH505TF variants tested here were often less infectious than their 293T counterparts but nonetheless remained adequately infectious for neutralization assays in TZM-bl cells (S1 Table), where only fusion-competent Env trimers are targets for neutralization [39]. Moreover, GnT1 production of the glycan-deleted viruses resulted in only modest increases in sensitivity to neutralization by HIV-1 sera, and did not render the viruses sensitive to most non-bnAbs tested (Fig 1), indicating that Man5-enrichment did not expose cryptic epitopes that are primary targets for neutralization on tier 1A viruses [40].

When assayed in TZM-bl cells, Man5-enriched CH505TF.gly4, CH505TF.gly3.276 and CH505TF.gly3.461 were moderately sensitive to neutralization by CH103 UCA (Fig 1, S1A Fig). In addition, Man5-enrichment of CH505TF and CH505TF.gly3.197 resulted in >10-fold increased neutralization by intermediates 4–8 of CH103 (Fig 1, S1C–S1G Fig). Despite these advantages for the UCA and intermediates of CH103, Man5-enrichment did not permit neutralization by CH235 UCA2 or the earliest CH235 intermediate tested (CH235_I4).

N279K and G458Y mutations

In an attempt to overcome the barrier to CH235 UCA2 neutralization, we combined Man5-enrichment with an N279K change in gp120 loop D that triggered the CH235 lineage in donor CH505. The N279K has been previously reported as the natural CH505 M5 variant of the CH505 transmitted/founder virus [32]. Another mutation, G458Y (V5 proximal), was found to make CH505TF/GnT1 moderately sensitive to neutralization by CH235 UCA2. Both mutations are resistance mutations for VRC01-class bnAbs [41, 42, 43, 44] but neither one imparts resistance to CH103, CH235 and CH235.12 (Fig 1). We examined N279K and G458Y in the context of CH505TF rather than the glycan deleted variants because glycan deletion provided little or no benefit and sometimes was detrimental for neutralization by CH235 intermediates I3 and I1 (Fig 1). The double mutation (N279K.G458Y) in CH505TF was synergistic in overcoming the barrier to CH235 UCA2 neutralization, with additional synergy provided by Man5-enrichment, resulting in a remarkable IC50 of 0.04 μg/ml against the Man5-enriched double mutant (Fig 1, Fig 2B and 2C, S1H Fig).

thumbnail

Fig 2. Neutralization by CH235 UCA2 predicts graded binding to corresponding SOSIP trimers.

(A) Overall strategy to identify and characterize engineered CH505TF Envs that engage CH235 UCA2. (B) Neutralization of parental and mutant CH505TF Env-pseudotyped viruses produced in either 293T or 293S GnTI cells and assayed with CH235 UCA2 in TZM-bl cells. Shown are representative curves from S1H Fig. (C) SPR binding of CH235 UCA2 to parental and mutant CH505TF SOSIP trimers produced in either Freestyle293 (293F) or 293S GnT1 cells. The apparent dissociation rate constant (KD) values are an average of two measurements (see S3 Fig). NB, no binding.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.g002

Neutralization potency was reduced 230-fold when the double mutant was not Man5-enriched (IC50 = 9.2 μg/ml), illustrating a strong synergistic effect of Man5 glycans. As single mutants, Man5-enriched N279K and G458Y were 92-fold and 973-fold less susceptible, respectively, than the Man5-enriched double mutant, illustrating potent synergy between the two mutations. Neither single mutant was neutralized >50% when not Man5-enriched. These combined observations point to a set of Env modifications that predict different magnitudes of interaction with CH235 UCA2. Several observations indicate that these interactions are not dependent on an open trimer conformation. Thus, Man5-enriched mutant viruses exhibited a tier 2 neutralization phenotype that is typical of a closed Env conformation yet is neutralized by CH235 UCA2. In addition, CH235 UCA2 did not neutralize the tier 1A virus CH505.w4.3, which represents an open conformation (Fig 1) [40]. Finally, the double mutant produced in 293T cells, which exhibits a tier 1A phenotype, was far less susceptible to CH235 UCA2 neutralization than the GnT1- version of this virus, which exhibits a tier 2 phenotype (Fig 1).

These two mutations, N279K and G458Y, also had an impact on intermediates of CH235. Man5-enriched N279K, G458Y and N279K.G458Y mutants were approximately 100–10,000-fold more sensitive to I4, and were 1.7–9.6-fold more sensitive to later intermediates of CH235 compared to Man5-enriched CH505TF (Fig 1, S1I–S1K Fig). These mutations had little or no impact on neutralization by VRC01gl, CH103 UCA and intermediates of CH103 compared to corresponding CH505TF produced in 293T and GnT1 cells (Fig 1, S1A–S1G Fig).

The remarkable neutralization of the N279K.G458Y virus by CH235 UCA2 led us to investigate whether further optimization was possible by substituting other amino acids at these two positions. Some amino acids were lethal to the virus and could not be tested. Among the substitutions at position 279 that were testable as Man5-enriched viruses, none proved superior to N279K (S2 Table). On the other hand, two substitutions at position 458 (G458C and G458L) provided modest improvement over G458Y as single mutants (S2 Table). Nonetheless, combining either G458C or G458L with N279K provided only 2-3-fold improved susceptibility to CH235 UCA2 and no improved susceptibility to the CH235 intermediates compared to N279K.G458Y (S2 Table).

CH235 UCA2 neutralization potency correlates with SOSIP binding

Because Env-pseudotyped viruses are not suitable as vaccine immunogens, we tested whether our findings translate to recombinant soluble native-like SOSIP.664 gp140 trimers as an alternate vaccine platform. The CH505TF SOSIP gp140 was stabilized by creating a chimeric SOSIP that contained select BG505 residues in gp120 and gp41 [33, 45]. Additionally, E64K and A316W were introduced to stabilize the Env in the closed conformation [23, 45]. Stabilized SOSIP versions of mutated and parental CH505TF were produced in Freestyle293 (293F) and 293S/Gn سلولهای T1 ( S2 Fig ) و اتصال میلگردهای نسبی به CH235 UCA2 توسط Resonance Surface Plasmon (SPR) اندازه گیری شد ( S3 Fig ). CH235 UCA2 با حساسیت زیاد (9 نانومتر) به Man 5 – CH505.N279K.G458Y متصل شده و با وابستگی های تدریجی پایین تر نسبت به سایر آنتی ژن ها محدود می شود ، همانطور که با قدرت خنثی سازی در برابر ویروس های مربوط به آنتی بادی پیش بینی شده پیش بینی شده است. ( شکل 2C ، S3 شکل ). این نتایج نشان می دهد که تریمرهای تثبیت شده SOSIP.664 ممکن است بستر مناسبی برای ادغام ویژگیهای هدفمند جوانه زنی باشد که با خنثی سازی مشخص شده اند.

ساختار Cryo-EM از CH235 UCA2 محدود به CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 Env.h3> تثبیت شده

برای درک مبنای ساختاری برای تشخیص CH235 UCA2 Env با N279K و جهشهای G458Y ، ما ساختار CH235 UCA2 را در مجتمع با Man 5 تحریک شده CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 با میکروسکوپ الکترونی عبوری (cryo-EM) تعیین کردیم ( شکل 3 ، S4 و S5 / a> انجیر ، جدول S3 ).

شکل 3. شکل SPAN جزئیات ساختاری Cryo-EM برای بازسازی مجموعه CH235UCA با اصلاح کننده HIV-1 Env CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664.

(A) Cryo-EM بازسازی CH235 UCA2 محدود به تثبیت CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 / GnT1 صاف کننده ، نشان داده شده توسط بخش با CH235 UCA2 رنگی سبز و HIV-1 Env رنگی خاکستری تقسیم شده است. (B) نمای بزرگنمایی رابط اتصال CH235 UCA2 با Env. حلقه اتصال Env CD4 به رنگ قرمز ، حلقه D در cyan و حلقه V5 به رنگ نارنجی نشان داده شده است. زنجیره سنگین CH235 UCA2 به رنگ سبز است ، به ترتیب حلقه های CHR H1 ، CDR H2 و CDR H3 به رنگ های بنفش ، قهوه ای و آبی رنگی هستند. زنجیره نور CH235 UCA2 به رنگ صورتی است ، به ترتیب حلقه های CDR L1 ، CDR L2 و CDR L3 به رنگ های سبز ، زرد و سرخابی رنگی است. نمای در سمت راست با توجه به نمای نمایش داده شده در سمت چپ ، 90 درجه در جهت عقربه های ساعت چرخانده می شود. (ج) نمای بزرگنمایی نشانگر تعامل CH235 UCA2 CDR L3 (مژگان) با حلقه HIV-1 Env D (سیان) و حلقه V5 (نارنجی). CDR H2 به رنگ قهوه ای نشان داده شده است. باقی مانده های تعاملی در نمای چوب نشان داده شده و خطوط نقطه سیاه نشانگر تعامل پیوند هیدروژن است. (D) سمت چپ ، بازسازی Cryo-EM از مجتمع CH235 UCA2-Env نشان داده شده در مشکی آبی با مدل مناسب زیربنایی که در نمایندگی کارتون نشان داده شده است. راست ، نمای بزرگنمایی در نمایانگر تعامل چهار جانبه CH235 UCA2 پایانه زنجیره سنگین (سبز) N با پروموتر مجاور (گندم). گلیکان 262 از پروتومر مجاور در نمای چوب نشان داده شده است

              https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.g003

/div>

طبقه بندی رایگان 2D از مرجع ذرات برداشت شده از مجموع 1،464 میکروگراف متناسب با قاب ، کلاس هایی را نشان داد که مطابق با Fab trimeric Env و هم چنین کلاس هایی هستند که مطابقت دارند گونه های کوچکتر مربوط به فاب ، به احتمال زیاد gp120 مونومر وابسته به Fab ( S4 شکل ). بازسازی ab նախաձեռնی em> ایجاد شده از جمعیت پیشین ، سه Fab را نشان داد که به طور متقارن در اطراف تریمور Env قرار دارند. پالایش سه بعدی مدل ab նախաձեռնی em> در برابر پشته تمیز ذرات ، بدون استفاده از تقارن ، سه Fab را که به HIV-1 Env متصل شده اند ، تأیید کرد ، پس از آن تقارن 3 برابری برای به دست آوردن نهایی اعمال شد. بازسازی که به وضوح کلی 4.2 ined تصفیه شده است ( شکل 3A ، S4 شکل ، جدول S3 ). وضوح بازسازی Cryo-EM در محدوده زمانی بین 4/8 تا 5/5 with با بالاترین وضوح مشاهده شده در هسته مجتمع و رابط Env / آنتی بادی ( S5A شکل ).

CH235 UCA2 Fab در محل اتصال CD4 محدود شد و به هر پروموتور نزدیک شد در زاویه ای مشابه آنچه قبلاً برای سازه های دیگر آنتی بادی های خونی CH235 مشاهده شده به gp120 مونومر مشاهده شده بود ( S6 شکل ) [ 31 ]. با وجود وضوح متوسط ​​بازسازی Cryo-EM ، چگالی برای رابط آنتی بادی-gp120 به خوبی برطرف شد ( S5 شکل ) ، اجازه می دهد تا محل قرار گیری مبهم از مکمل مناطق تعیین کننده (CDR) آنتی بادی ، و همچنین اپیتوپ آن بر روی Man 5 – غنی شده CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 Env.

CH235 UCA2 Fab از CDR H2 خود برای واسطه سازی کلیدهای ارتباط با حلقه اتصال gp120 CD4 ( شکل 3B ) ، نمایش تظاهرات CD4 که معمولی برای کلاسهای VRC01 و CH235 / 8ANC131 آنتی بادی های CD4bs حاصل از VH1-2 است و ژن های Germ Germline زنجیره سنگین VH1-46 ، به ترتیب ( S6 شکل ) [ 46 ، 47 ، 48 ، 49 ]. CH235 UCA2 همچنین ارتباطات گسترده ای با حلقه D و حلقه V5 ، که مکان جهش های N279K و G458Y هستند ، به ترتیب ( شکل 3B و 3C ، S5 و S6 انجیر). CH235 UCA2 با حلقه D در درجه اول از طریق CDR H3 و CDR L3 ارتباط برقرار می کند ( شکل 3B و 3C ، S5B –S5E شکل ). همچنین با زنجیره جانبی حلقه D K282 از طریق باقیمانده Y33 در حلقه CDR H1 ( S5E Fig ) تماس گرفت. زنجیره جانبی gp120 K279 یک ترکیب گسترده را ایجاد کرد که به آن اجازه می داد تا در برابر زنجیره جانبی N93 در CH235 UCA2 CDR L3 جمع شود و یک تماس وان در واکس با زنجیره جانبی gp120 F353 تشکیل دهد ( شکل 3C ، شکل S5D ). CH235 UCA2 CDR L3 از طریق پیوند هیدروژن بین نیتروژن ستون فقرات gp120 K279 و اکسیژن کربونیل ستون فقرات UCA N92 و دو پیوند هیدروژن دیگر بین زنجیره جانبی gp120 N280 و UCA با منطقه حلقه D اطراف حلقه D ارتباط برقرار کرد. کربونیل های زنجیره اصلی باقیمانده های N92 و N93. زنجیره جانبی UCA W95 همچنین با gp120 N280 در تعامل است. CH235 UCA2 CDR L3 با اثر متقابل آن با حلقه D و حلقه V5 در جای خود قفل شد ، UCA W94 با تعامل کاتیون-پی و پی-پشته ای که توسط واسطه حلقه های V5 مانده R456 و Y458 توقیف می شود ( شکل 3C ، S5B و S5C شکل ). جدا از تعامل با CDR L3 ، زنجیره جانبی موتور gp120 Y458 مهندسی شده نیز در برابر CDR H2 CH235 UCA2 ( شکل 3C ، S5B و S5C Fig ). ما ساختارهای CH235 UCA2 محدود Env را که در این مطالعه تعیین شده است با ساختار CH235.12 محدود شده با gp120 که قبلاً با استفاده از کریستالوگرافی با اشعه ایکس تعیین شده بود مقایسه کردیم [ 31 . ما دریافتیم که آنتی بادی ها Env را با زوایای مشابه رویکردی مرتبط می کنند ( S6A و S6B شکل ). تعامل با عناصر مهم Env مانند حلقه اتصال CD4 ، حلقه D و حلقه V5 حفظ شد. تغییر در ترکیب در حلقه V5 برای جای گرفتن زنجیره جانبی بزرگ تیروزین از تعویض G458Y مشاهده شد ( S5 و S6 شکل ).

علاوه بر جهش های N279K و G458Y ، Man 5 – غنی سازی trimer CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 اتصال به CH235 UCA2 را افزایش داده است. در بازسازی cryo-EM ، اگرچه برای تعدادی از قسمتهای گلیکان مجاورت سایت اتصال CD4 در اکثر سایتها چگالی مشاهده کردیم ، نقشه به اندازه کافی مناسب نبود تا بتواند مدلهای گلیکان را با استفاده از استریوشیمی درست تنظیم و اصلاح کند. با این حال ، گلیکان 262 چگالی مناسب و منطقی را نشان داد که توانستیم متناسب با آن قرار بگیریم. ما مشاهده کردیم که گلیکان 262 از پروموتور مجاور ، چگالی به خوبی تعریف شده نزدیک به CH235 UCA2 محدود را نشان داد. برای به دست آوردن بینش در مورد اثر غنی سازی Man 5 ، ما ساختار محدود CH235 UCA2 را با ساختار HIV-1 clade A BG505 SOSIP.664 پیش نمایش Env در پیچیده با bnAbs PGT122 و 35022 (PDB) تراز کردیم. شناسه: 5FYL) ، جایی که SOSIP در سلولهای 293F بیان شده است ، بنابراین گلیکان نوع پیچیده حاصل می شود. ما فهمیدیم که گلیکان 301 و 262 از پروتروم کواترنر ، هنگامی که به شکل پیچیده ای هستند ، می توانند مسیر نزدیک شدن CH235 UCA2 را مانع کنند ( S6I و S6J Fig ) . ما همچنین یک تماس چهار جانبه در تراکم cryo-EM بین پایانه N زنجیره سنگین CH235 UCA2 و محل کواترنر تعامل CD4 در برش Env مشاهده کردیم ( شکل 3D ) [ 50 ]. به طور خلاصه ، ساختار cryo-EM بینشهای سطح اتمی را در مورد چگونگی اجازه جهشهای G458Y و N279K با اتصال زیاد میل بین مهندسین مهندس CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 و CH235 UCA2 فراهم می کند.

ترکیبی از داده های خنثی سازی و داده های ساختاری پشتیبانی جدی را برای تعامل پایدار و عملکردی مناسب بین آنتی بادی ژرمینال استنباط شده CH235 UCA2 و CH505TF.N279K.G458Y Env. این به ما منجر می شود تا فرضیه اولیه واکسیناسیون با پروتئین SOSIP.664 از نظر ساختاری پایدار این Env ، سلولهای ساده B را تحمل آنتی بادی ژرمینلین برای دودمان CH235 bnAb تحریک کند. در واقع ، هدف قرار دادن میکروب CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 / GnT1 پیش سازهای اولیه CH235 در موش های چاقو در CH235 UCA2 ناشی از ایمونوژن ، و غلبه بر جهش زنجیره سنگین K19T غیر ممکن و ناشی از خنثی سازی امضا مطابق با پیش سازهای اولیه CH235 در ماكس های رزس (Saunders و همكاران ، ارسال شده). همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است و در زیر مورد بحث قرار گرفته ایمونوژن هایی که دارای ترکیبات مختلف N279K ، G458Y و / یا Man 5 هستند – پتانسیل را دارند استراتژی های تقویت کننده اصلی برای تعیین موثرترین مسیر بلوغ از پیش ماده اولیه تا بلوغ بلوغ.

شکل 4. شکل 4. استراتژی های ایمن سازی برای شروع و بالغ شدن خطوط CH235 BnAbs. p>

یک استراتژی برای استخراج b2Abs بطن CH235 با ترسیم اولیه با ایمونوژن که پیش بینی می شود سلولهای B ساده و متناسب با روابط بالا ، متوسط ​​یا پایین را درگیر می کند ارائه شده است. ایمنی زایی متعاقب آن افزایش می یابد و با حرکت جهش های سوماتیکی لازم برای اسکان N279 ، G458 و یک سپر گلیکان کاملاً پردازش شده ، پاسخ را بالغ می کند. انتخاب تقویت کننده ایمونوژن ها به قسمتی بستگی دارد که ایمونوژن زایشی اولیه برای القای پیش ساز بهینه باشد. ایمونوژنهای غنی شده از انسان 5 در سلولهای GnT1 تولید می شوند و ایمونوژنهای کاملاً گلیکوزیله شده در سلولهای 293F یا معادل تولید می شوند ، جایی که سلولهای هر دو ایمنی برای GMP تأیید می شوند. ساخت. p>

              https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.g004

ابزاری برای نظارت بر ایمنی بدن

توانایی تشخیص UCA ها و واسطه های CH103 و CH235 / CH235. 12 در روش های خنثی سازی ، ابزارآزمایی مانیتورینگ سیستم ایمنی در کارآزمایی های بالینی و بالینی را دارد. براساس نتایج ما ، پیش بینی می شود CH505TF.N279K.G458Y / GnT1 برای تشخیص پیش سازهای اولیه واکسینه شده از دودمان CH235 / CH235.12 ، که در آن نمونه های تست مثبت ممکن است حساس باشد knock-N280D برای تأیید ویژگی CD4bs ( شکل 1 ، S1H و S1I شکل a>) سنجش با ویروس های جهش یافته رشد 239T و والدین CH505TF / GnT1 والدین می تواند مورد استفاده قرار گیرد تا نیاز به انسان و همچنین جهش زایی را به عنوان اثبات برای امضای خنثی سازی کامل که با CH235 UCA2 دیده می شود. یک نکته احتیاطی این است که نسخه 293T از جهش دوتایی یک فنوتیپ ردیف 1A را نشان می دهد و آنتی بادی هایی را که به راحتی ایجاد می شوند مستقل می کنند که یک ترکیب تریمر باز را به هم متصل می کنند ، مستعد می شوند. این نیاز به تفسیر نتایج با این ویروس تولید شده در سلولهای 293T در نظر گرفته می شود. خوشبختانه نسخه GnT1 ویروس یک فنوتیپ ردیف 2 را نشان می دهد ، که مستعد ابتلا به این آنتی بادی هایی نیست که به راحتی القا می شوند و باعث می شود ویروس برای آنتی بادی های مورد علاقه بیشتر انتخاب شود.

CH505TF.gly4 / GnT1 است پیش بینی می شود برای تشخیص پیش سازهای اولیه واکسن ناشی از CH103 بسیار حساس باشد ( شکل 1 ). تأیید ویژگی CD4bs با N280D و سایر جهش های مقاومت در برابر CD4bs bnAb شناخته شده نیست زیرا این جهش ها مقاومت به CH103 و واسطه های آن را ایجاد نمی کند. برای طراحی یک ویروس حذفی اپی توپ مناسب ، جهش نقطه اضافی مورد بررسی قرار گرفت که در ساختارهای بلوری تماس با CH103 هستند اما CD4 نیستند (برای حفظ عفونت). سه جهش در V5 (N461A ، N462A و T463A) هیچ تاثیری جز جهش چهارم در حلقه اتصال CD4 (S365P) به مقاومت در برابر UCA و واسطه ها نداد در حالی که مقاومت به CH103 بالغ را تحویل نمی دهد ( جدول S4 ). با استفاده از این جهش زدم ، اکنون مجموعه هایی از ویروس ها وجود دارد که می توانند UCA ها و واسطه های CH103 و CH235 / CH235.12 را تشخیص دهند ، مراحل میانی را شناسایی کرده و ویژگی اپی توپ را با ویروس های انتخابی مقاوم تأیید کنند. اینها ابزارهای ارزشمندی برای ارزیابی پیشرفت آنتی بادی در کارآزمایی های بالینی قبل از کارآزمایی و کلینیکی با هدف استخراج bnAbs CH103- و CH235 مانند خواهند بود.

بحث

خنثی سازی ویروس مبتذل شده به ابزاری قدرتمند برای هدایت طراحی واکسن های HIV-1 مبتنی بر دودمان bnAb تبدیل می شود [ 29 ، 51 ]. در اینجا ، خنثی سازی ویروس شناسایی یک استراتژی واکسن با هدف استخراج صفات CH103 و CH235 / CH235.12 از CD4bs bnAbs را هدایت کرد. ویژگی های مهندسی مورد استفاده قرار گرفتند که ویروس اتولوگ CH505TF را به خنثی سازی توسط واسطه های برگشت یافته و زودهنگام CH103 و CH235 / CH235.12 حساس به خنثی سازی تبدیل می کنند ، جایی که خنثی سازی به عنوان یک جانشین برای بومی سازی Env اتصال داده می شود. بر خلاف ویژگی های ویروس 426c حساس به خنثی سازی توسط bnAbs کلاس VRC01 با استفاده از برگهای گرم شده [ 29 ] ، حذف گلیکان همراه با Man 5 غنی سازی سد خنثی سازی توسط CH235 UCA2 غلبه نکرد. با این وجود ، ترکیب گلیکان حذف و Man 5 – غنی سازی برای CH103 UCA تا حدی موفقیت آمیز بود ، و حذف گلیکان به تنهایی برای همه واسطه های CH103 به جز اولین واسطه آزمایش شده موفقیت آمیز بود ( شکل 1 ).

سد خنثی سازی توسط CH235 UCA2 با تعامل هم افزایی بین دو جهش پیش بینی شده ، یکی برطرف شد در حلقه D (N279K ، که یک N -glycan) را حذف نمی کند و دیگری در V5 (G458Y). هم افزایی قدرتمند اضافی توسط غنی سازی Man 5 ارائه شده است. N279K و G458Y مقاومت در برابر bnAbs کلاس VRC01 مانند VRC01 و 3BNC117 را تحمل می کنند ، اما مقاومت در برابر بلوک های CH103 و CH235 / CH235.12 را در چارچوب CH505TF ( ایجاد نکنید. شکل 1 ). مطالعات ساختاری قبلی نشان داده اند که اعضای اولیه CH235-lineage مناطقی را تشخیص می دهند که همگی برتری آسیب پذیری CD4 را شامل می شوند ، همچنین مناطقی که خارج از این قسمت فوقانی هستند و شامل حلقه gp120 D و V5 هستند [ 48 ]. hypermutation جسمی متشکل از شناسایی آنتی بادی های بالغ تر از اصل و نسب در بالای CD4 از آسیب پذیری [ 31 ]. مطابق با این یافته های قبلی ، ما یک سطح تعاملی بزرگ از CH235 UCA2 در حلقه های D و V5 مشاهده کردیم ، با بقایای جهش یافته Env در موقعیت های gp120 279 و 458 مستقیماً در تعامل با آنتی بادی نقش دارند. ساختار cryo-EM نقش اصلی حلقه CH235 UCA CDR L3 را در شناخت هر دو حلقه مهندسی gp120 D و V5 نشان داد ( شکل 3C ، S5B شکل ). تعامل بین زنجیره جانبی باقی مانده حلقه D gp120 D K279 با CH235 UCA2 CDR L3 ، و همچنین با دیگر مناطق gp120 ( شکل 3C ، S5C Fig ) ، نقش جهش N279K را در تثبیت ساختار حلقه D و فعال کردن تعامل آن با CH235 UCA2 CDR L3 پیشنهاد کرد. به همین ترتیب ، جهش gp120 حلقه V5 G458Y جیپی کوچک را با یک زنجیره جانبی بزرگ Tyr جایگزین کرد و فعل و انفعالات وان در وال را با CH235 UCA2 CDR L3 مانده W94 فعال کرد ( شکل 3C a> ، S5B و S5C Fig ). این نتایج ساختاری نشان می دهد که چگونه جهش های N279K و G458Y برای تثبیت تعامل Env با حلقه CDR L3 CH235 UCA2 همکاری می کنند ، و اتصال CH235 UCA2 را به CH505TF.N279K.G458Y Env.

ما همچنین دریافتیم که میزان خنثی سازی ویروس توسط CH235 UCA2 با همبستگی های مرتبط با تریمرهای SOSIP CH505TF ( شکل 2 ) ، نشان می دهد که تریمرهای SOSIP ممکن است بستر مناسبی برای ترجمه یافته های هدایت شونده خنثی سازی ما به سیستم ایمنی زنده باشد. شکل 4 نشان می دهد که چگونه می توان از این سلولهای ایمنی در یک استراتژی مهندسی معکوس با هدف قرار دادن جوانه و هدفگذاری استفاده کرد تا از این طریق خط تولید CH235 bnAb را آغاز کند. تریمرهای SOSIP CH505TF که سطوح مختلف فعال سازی سلول B را تحریک می کنند ، فرصتهایی را برای تعیین شرایط بهینه ترشی برای شروع سلسله دارند. تقویت با سیستم ایمنی با موتور معکوس قصد دارد سلولهای B را برای اسیدهای آمینه از نوع وحشی در موقعیت های 279 و 458 و یک سپر گلیکان کاملاً پردازش شده قرار دهد. ناهمگونی طبیعی در ترکیب گلیکان در سایتهای اشغالی [ 52 ، 53 ] اسکان نهایی یک سپر گلیکان “کاملاً پردازش شده” را تسهیل کنید.

واقعیت این است که N279K یک گلیم N- را حذف نمی کند احتمال ایجاد پاسخ گلیکان سوراخ مخصوص این سایت را کاهش می دهد

آزمایش تکراری ترکیبات مختلف تریمرهای مهندسی CH505TF SOSIP مهندسی شده در نهایت ممکن است منجر به شناسایی یک رژیم موفق. در پشتیبانی از این استراتژی ، CH505.N279K.G458Y SOSIP / GnT1 ، که دارای 9 نانومتر میل برای CH235 UCA2 است ( شکل 2 a > ، S3 شکل ) ، پیش سازهای اولیه CH235 را در موش های ضربدری CH235 UCA2 القا می کند ، بر غلبه بر جهش زنجیره سنگین K19T غیرممکن. در حالی که CH505.N279K gp120 ، که میل کمتری برای CH235 UCA2 دارد ، این پیشروها را القا نمی کند (Saunders و همکاران ، ارسال شده). مطالعات اضافی در حال انجام است که هدف آنها افزایش بلوغ این پاسخ در موش ها و ترجمه این استراتژی به مدل های حیوانات مرتبه بالاتر است. پیشرفت در این و دیگر استراتژی های ایمن سازی با هدف استخراج سلسله CH235 bnAb را می توان در سنجش خنثی سازی با ویروس های مبتنی بر CH505TF Env-pseudotyped مهندسی شده که پیش سازهای اولیه را تشخیص می دهند ، مورد بررسی قرار گرفت. توجه داشته باشید ، این سیستم ایمنی ممکن است پاسخهای خارج از هدف ، مانند آنتی بادی در برابر اپی توپهای در معرض در تریمرهای باز [ 40 ] ایجاد کند ، تقریباً مشابه در HIV- 1 نفر از افراد آلوده ، از جمله منبع دهنده CH103 و CH235 [ 30 ]. این که و چگونه این پاسخ های هدف غیرفعال بر توانایی استخراج bnAbs از طریق واکسیناسیون تأثیر می گذارد ، ناشناخته است. p>

به طور خلاصه ، خنثی سازی ویروس Env-pseudotyped اجازه شناسایی دو جهش Env را داد که همزمان با هم عمل کردند برای ارائه CH505TF به خنثی سازی توسط CH235 UCA2 ، با هم افزایی اضافی ارائه شده توسط Man 5 تقویت شده N – گلیکان ، بسیار حساس به خنثی سازی. قدرت خنثی سازی با اتصال میل به نانومولار مرتبط با برشهای SOSIP مربوط به عنوان سیستم ایمنی بدن در ارتباط است. این یافته ها یک رویکرد واکسن مبتنی بر اصل و نسب را نشان می دهد که با هدف استخراج bnAbs CH235 / CH235.12 مانند و ارائه یک استراتژی مبتنی بر خنثی سازی برای نظارت بر پیش سازهای اولیه واکسن ناشی از این سلسله نژاد bnAb انجام می شود.

روش ها h2>

بیانیه اخلاق

این مطالعه با استفاده از نمونه های سرم انسانی از قبل موجود ، شناسایی نشده به دست آمده از مخزن ایمونولوژی واکسن HIV (CHAVI) مرکز دوک تحت تأیید هیئت بررسی مؤسسه سیستم سلامت دانشگاه دوک (Pro00015593). داده ها به صورت ناشناس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

سلول

TZM-bl، HEK 293T / 17 و HEK 293S / GnT1 – در گلدان های اصلاح شده Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) حاوی 10٪ سرم گاوی جنین (FBS) و جنتامایسین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) در فلاسک های کشت شده T-75 تهویه (Corning-Costar) نگهداری شدند. کشت در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط مرطوب 5٪ CO2-95٪ هوا انکوبه شد. تک لایه های سلولی 1:10 در محل تلاقی با تیمار با 0.25٪ تریپسین ، 1 میلی متر EDTA تقسیم شدند.

آنتی بادی ها و سرم HIV-1

VRC01 [ 54 ] ، VRC34.01 [ 55 ] و 10E8 [ 56 / a>] توسط مرکز تحقیقات واکسن ، NIH تولید شده است. N6 [ 57 ] از دکتر مارک کانرز به دست آمد. 3BNC117 [ 58 ] و 10-1074 [ 59 ] از Dr. میشل نوسنزویگ. VRC-CH31 و CH01 [ 60 ] توسط Catalent Biologics (مدیسون ، WI) تولید شد. DH511.2_K3 [ 61 ] توسط مؤسسه واکسن انسانی ، مرکز پزشکی دانشگاه دوک تولید شده است. HJ16 [ 62 ] از دکتر داوید کورتی بدست آمد. B12 [ 63 ] ، 2G12 ، 2F5 ، 4E10 ، PG9 و PG16 از Polymun Scientific (کلوزترنوبورگ ، اتریش) خریداری شد. PGDM1400 [ 64 ]، PGT121 [ 65 ]، PGT128 [ 65 ] و PGT151 [ 35 ] هدیه ای مهربان از دکتر دنیس بارتون بودند. VRC01 ، 3BNC117 ، VRC-CH31 و N6 متعلق به کلاس VRC01 از bnAbs هستند که با تقلید زنجیره سنگین گیرنده CD4 ، استفاده از ژن ژرمینال VH1-2 و یک اسید آمینه CDRL3 مشخص می شود.

علاوه بر این bnAbs بالغ ، ما از UCA ، واسطه ها و بالغ استفاده کردیم اشکال CH103 و CH235 / CH235.12 [ 31 ، 32 ] ، که توسط مؤسسه واکسن انسانی ، مرکز پزشکی دانشگاه دوک ، دورام ، کارولینای شمالی تولید شده است. توالی جد مشترک بدون وقفه (UCA) برای خاندان CH235 / CH235.12 مورد استفاده در این مطالعه با یک اسید آمینه از UCA که قبلاً شرح داده شده متفاوت است [ 31 ] . UCA مورد استفاده در اینجا ، که ما از آن به عنوان CH235 UCA2 یاد می کنیم ، یک متیونین در موقعیت 4 زنجیره نور به جای یک لوسین در نسخه UCA که قبلاً شرح داده شده است ، دارد. ما همچنین شامل یک فرم برگردانده شده از جوانه ای VRC01 [ 46 ] است که در مرکز تحقیقات واکسن ، NIH تولید شده است. این آنتی بادی برگردانده شده با ژرمینال دارای نواحی بالغ HCDR3 و J است که ژلهای آن با اطلاعات توالی موجود نمی توانند استنباط شوند. توالی های زنجیره ای سنگین و سبک آنتی بادی های برگشت یافته و واسطه ای که به ژرمین منتقل می شوند ، ممکن است در LaBranche و همکاران یافت شود. [ 29 ].

فنوتیپ ردیف خنثی سازی با استخرهای سرمی از افراد جنوب آفریقا انجام شد ( آفریقای جنوبی ، مالاوی و تانزانیا) که در یک مطالعه CHAVI در مورد عفونت مزمن HIV-1 شرکت کردند (نمونه CHAVI 0293 ، 0537 ، 0642 ، 0461 و 0598). این افراد مورد مطالعه حداقل به مدت سه سال آلوده شده بودند. نمونه ها از 6-10 نقطه زمانی جمع آوری شده در طی 8 تا 60 ماه بر اساس موضوع و به مدت 30 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد غیر فعال شدند. برای بازجویی عمیق تر از فنوتیپ خنثی سازی ، مجموعه ای از آنتی بادی های مونوکلونال که نشان دهنده اولویت قوی برای ویروس های ردیف 1 است استفاده شد. این مجموعه شامل آنتی بادی های اختصاصی V3 2219 [ 66 ] ، 2557 [ 67 ] ، 3074 [ 68 ] ، 3869 [ 69 ]، 447-52D [ 70 ] و 838-D [ 71 ] و آنتی بادی های CD4bs 654-30D [ 72 ] ، 1008-30D [ 73 ] ، 1570D [ 73 ] and 729-30D [ 74 ] تولید شده توسط Drs. سوزان زولا پازنر و میروسلاو K. گورنی در دانشگاه نیویورک و مرکز پزشکی امور ایثارگران ، نیویورک ، نیویورک. همچنین شامل آنتی بادی CD4bs F105 [ 75 ] تولید شده توسط مرکز تولید پروتئین در موسسه واکسن انسانی دوک است. p>

پیشینه های pseudotyping

جزییات عملکردی HIV-1 با طول کامل برای رمزنگاری ویروس استفاده شد. گزارش های قبلی Envs برای سویه های CH505TF و CH505.w4.3 [ 31 ] را شرح داده است. گلیکان حذف Envs CH505TF.gly4 ، CH505TF.gly197 ، CH505TF.gly3.276 و CH505TF.gly3.461 قبلاً [ 33 ] شرح داده شد. در برخی موارد جهش های اضافی معرفی شده توسط جهش زایی به کارگردانی سایت به شرح [ 76 ].

انتقال

ویروس های Env-pseudotyped در 293T / 17 یا 293S GnT1 تولید شدند سلول های (مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی) به شرح [ 77 ]. سلولهای 293S GnT1 فاقد آنزیم N- استیل گلوکزوزامینیل ترانسفراز هستند و نشان داده شده است که دارای HIV-1 Envs هستند که حاوی گلیکوفرم های 6-9 Man هستند. غنی شده برای گلیکوفرم های 5 تحت پردازش شده به جای گلیکان های پیچیده [ 37 ، 78 ]. ویروس های شبه انتی با انتقال سلول های تقسیم 293T / 17 یا 293S GnT1 (5 X 10 6 ) در 12 میلی لیتر رشد در یک فلاسک کشت T-75 ایجاد شدند. ) با 4 میکروگرم پلاسمید بیان re / env و 8 میکروگرم از یک وکتور کمبود HIV-1 ستون فقرات HIV (pSG3ΔEnv) ، با استفاده از معرف ترانسفکشن Fugene 6. سلولها پس از 3-8 ساعت شسته شدند و در محیط رشد تازه بدون معرفهای ترانسفکشن انکوبه شدند. رویی های حاوی ویروس حاوی محیط ویروس با شبه مخلوط 2 روز پس از ترانسفکشن جمع آوری شدند ، فیلتر شدند (45/0 میکرومتر) و در دمای 80 درجه سانتیگراد در مقادیر 1 میلی لیتری ذخیره شدند. میزان آلودگی در سلولهای TZM-bl اندازه گیری شد با انجام سریال های رقت 5 برفکی شبه ویروسی در چاه های چهارگانه در صفحات کشت 96 چاه در حجم کل 100 میکرولیتر از محل رشد برای کل 11 مرحله رقت. سلولهای تازه تریپسینه شده (10،000 سلول در 100 میکرولیتر از محیط رشد حاوی 75 میکروگرم در میلی لیتر DEAE-دکستران) به هر چاه اضافه شدند ، و صفحات در دمای 37 درجه سانتیگراد در 5٪ CO رطوبت انکوبه شدند. 95٪ محیط هوا پس از 48 ساعت جوجه کشی ، 100 میکرولیتر از محیط کشت از هر چاه برداشته شد و 100 میکرولیتر از ماده معرف بریتانیا به سلول ها اضافه شد. پس از 2 دقیقه جوجه کشی در دمای اتاق به منظور اجازه لیز سلول ، 150 میکرولیتر لیز سلول برای اندازه گیری لومینسانس با استفاده از یک لومینومتر ویکتور 3 به صفحه های جامد سیاه 96 چاه (کورنینگ-کوستار) منتقل شد (پرکین-المر زندگی علوم ، شلتون) ، سی تی اسکن) رقت از ویروس که منجر به 50،000-250،000 واحد لومینسانس نسبی (RLUs) برای سنجش خنثی سازی استفاده شد.

روش خنثی سازی

سنجش های خنثی سازی در سلول های TZM-bl انجام شد (تحقیقات ایدز NIH و برنامه معرف مرجع ، با کمک جان کاپس و Xiaoyun وو) شرح داده شده است [ 77 ]. به طور خلاصه ، یک دوز از پیش تیتراسیون ویروس Env-pseudotyped با رقیق سری 3 یا 5 برابر نمونه آزمایش در نسخه برداری در حجم کلی 150 میکرولیتر در مدت زمان 1 ساعت در 37 درجه سانتیگراد در 96 چاه تخت کف انکوبه شد. صفحات فرهنگ. سلولهای تازه تریپسینه شده (10،000 سلول در 100 میکرولیتر از محیط رشد حاوی 20 میکروگرم در میلی لیتر دکستران DEAE) به هر چاه اضافه شدند. يك مجموعه چاههاي كنترل سلولها ويروس (كنترل ويروس) را دريافت كرده و مجموعه ديگر فقط سلولها (كنترل زمينه) را دريافت كرده اند. بعد از 48 ساعت جوجه کشی ، سلول ها با افزودن بریتلیت (علوم زندگی PerkinElmer Life) لیز شدند و سه چهارم لیز سلول به یک صفحه جامد سیاه چاه 96 (Costar) برای اندازه گیری لومینسانس منتقل شد. عناوین خنثی سازی یا رقیق سازی سرم (ID50) یا غلظت آنتی بادی (IC50) است که در آن واحد لومینسانس نسبی (RLU) 50 درصد در مقایسه با چاه های کنترل ویروس بعد از تفریق RLU های پس زمینه کاهش یافته است. برای کلیه نتایج گزارش شده ، میانگین RLU چاههای کنترل ویروس> 10 برابر میانگین RLU چاههای کنترل سلولی ، درصد ضریب تغییر (٪ CV) بین RLU در چاههای کنترل ویروس 30٪ the بود ، که اختلاف در درصد بین تکراری است. چاه ≤30، بود ، و منحنی خنثی سازی عبور از 50 neutral خنثی سازی 0-1 بار. مقادیر و منحنی های خنثی سازی ، مگر در مواردی که بیان شده یا تصویر شده باشد ، از یک روش واحد (چاه های تکراری) است.

طراحی تثبیت شده HIV-1 SOSIP gp140s

CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 با استفاده از BG505 تثبیت شد طراحی کیمریک که در آن CH505TF gp120 به دنباله BG505 SOSIP gp140 پیوند زده شد و منجر به 29 تغییر اسید آمینه از دنباله CH505TF والدین شد [ 33 ، 45 ]. علاوه بر این ، جهشهای E64K و A316W برای تثبیت ترکیب مقید قبل از CD4 و جلوگیری از قرار گرفتن در معرض حلقه V3 [ 23 ، 45 ]. جهشهای N279K و G458Y در ترکیب های مختلف به این طرح SOSIP اضافه شد

تولید نوترکیب HIV-1 gp140 SOSIP

gp140s SOSIP بیان شد ، تصفیه شده و همانطور که قبلاً با اصلاحات جزئی توصیف شده بود [ 45 ]. تولید SOSIP با سلول های Freestyle293 (293F) یا سلول های 293S GnT1 انجام شد تا SOSIP ها را با ناهمگن یا Man 5 GlcNac 2 – گلیکوزیلاسیون تقویت شده ، به ترتیب. قبل از ترانسفکشن ، سلولهای 293 GnT1 در محیط ESF SFM (سیستمهای بیان) کشت داده شدند و در حجم مساوی با رسانه Freestyle293 مخلوط شدند. در روز انتقال ، سلول های Freestyle293 و 293S GnT1 به سلول های 1.25×10 6 / ml با رسانه های تازه Freestyle293 تا حداکثر 1L حجم رقیق شدند. سلولها با DNA پلاسميدي با 293Fectin پيوند داده شدند. برای هر تركیبكننده 1L ، 650 میكروگرم از پلاسمید بیانگر SOSIP و 150 میكروگرم پلاسمید بیانگر فورین استفاده شد. در روز 6 ، مایع رویی کشت سلولی توسط سانتریفیوژ کشت سلول به مدت 30 دقیقه در 3500 دور در دقیقه جمع آوری شد. رویی عاری از سلول از طریق یک فیلتر 0.8 میکرومتر فیلتر شده و با یک کاست فیلتراسیون جریان یکبار استفاده مایع به کمتر از 100 میلی لیتر متمرکز شد و دوباره 0.8 میکرومتر فیلتر شد. پروتئین SOSIP با کروماتوگرافی میل ترکیبی PGT145 خالص شد. یکصد میلی گرم آنتی بادی PGT145 IgG1 به 10 میلی لیتر رزین FastFlow فعال شده با CnBr CFB (GE Healthcare) کونژوگه شد. رزین همراه با ستون Tricorn (GE Healthcare) بسته بندی شد و در PBS با 0.05٪ آزید سدیم ذخیره شد. مایع رویی بدون سلول با استفاده از یک AKTA خالص (GE Healthcare) به ستون در 2 میلی لیتر در دقیقه اعمال شد ، شسته شد و پروتئین با 3M MgCl 2 از ستون خارج شد. این عصاره بلافاصله در 10 میلی متر تریس pH 8 رقیق شد ، 0.2 میکرومتر فیلتر شد و برای کروماتوگرافی محرومیت از اندازه تا 2 میلی لیتر متمرکز شد. کروماتوگرافی محرومیت اندازه با یک ستون Superose6 16/600 (GE Healthcare) در 10 میلی متر Tris pH 8 ، 500 میلی متر NaCl برای شناسایی پروتئین تریمری انجام شد. کسرهای حاوی پروتئین HIV-1 Env trimeric در کنار هم قرار گرفتند ، فیلتر شده با استریل ، مواد منجمد فوری و در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شدند.

شکل گیری تریمرها توسط میکروسکوپ الکترونی الکترونی لکه ای تعیین شد ( S4 Fig ). میانگین کلاس دو بعدی بی طرف با EMAN2 [ 45 ] تولید شد. شکل گیری تریمر همچنین توسط کروماتوگرافی محرومیت از اندازه تحلیلی و بومی- PAGE آبی تأیید شد. آنتی ژنی تریمرهای موجود در محلول با استفاده از تداخل سنج بیو لایه تعیین شد ( S4 شکل ).

تشدید پلاسمون سطح (SPR)

ثابت نرخ و ثابت سرعت تفکیک آشکار (K D ) اتصال CH235 UCA2 به پروتئین های SOSIP trimeric توسط رزونانس پلاسمون سطح (SPR) با استفاده از Biacore 3000 (GE بهداشت و درمان) انجام شد ، همانطور که قبلاً شرح داده شد [ 79 ] از یک تراشه حسگر CM3 برای بی حرکت مستقیم حدود 4500 RU (واحد پاسخ) یک آنتی بادی ضد انسانی IgG Fc بز (Millimore / Sigma ، Bedford، MA) استفاده شد. آنتی بادی IgG Fc سپس برای ضبط آنتی بادی CH235 UCA2 به سطح 200-350RU استفاده شد. پروتئین ها از 50nM-750nM در بافر HBS-EP (GE بهداشت و درمان) رقیق شدند و سپس به مدت 5 دقیقه در 50 ul / min به بیش از سطوح ضبط شده آنتی بادی تزریق شدند. 5 دقیقه بعد از تزریق آنالیت ، یک دوره جداسازی 10 دقیقه با شستشوی بافر و سپس پالس تزریق 20 ثانیه از گلیسین pH 2.0 برای بازسازی انجام شد. نتایج سینتیک با استفاده از نرم افزار BIAevaluation 4.1 (GE Healthcare) تجزیه و تحلیل شد. یک آنتی بادی کنترل منفی ، Ab82 (هماناگلوتینین ضد آنفلوانزا ، کاتالان) و اتصال بافر برای تفریق مضاعف مرجع مورد استفاده قرار گرفت تا حسابرسی اتصال غیر اختصاصی و کشش سیگنال را به خود اختصاص دهد. تجزیه و تحلیل اتصالات منحنی بعدی با استفاده از یک مدل 1: 1 لانگمویر با Rmax محلی انجام شد و ثابت سرعت گزارش شده نماینده 2 اندازه گیری است. p>

جمع آوری و پردازش داده های Cryo-EM

برش Env مورد استفاده در cryo-EM در GnT1 تولید شد – خط سلولی همانطور که در بالا توضیح داده شد. برای تهیه مجتمع های Env ، CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 در غلظت نهایی 1 میلی گرم در میلی لیتر با 4/5 برابر بیش از حد مولی قطعات CH235 UCA2 Fab برای 30-60 دقیقه انکوبه شد. برای جلوگیری از تجمع در طی انجماد ، نمونه در 0.085 میلی متر دودسیل مالتوزید (DDM) انکوبه شد. نمونه با استفاده از 2.5 میکرولیتر از نمونه به شبکه های کربن Quantifoil holey تازه تمیز شده با پلاسما (1 / 1.3 / 1.3-3C) لخته شد ، اجازه می دهد تا نمونه برای 60 ثانیه به شبکه جذب شود ، و به دنبال آن با استفاده از کاغذ فیلتر و غوطه ور شدن در انجماد. اتان مایع با استفاده از پیوند لایه لایه ای Leica EM GP (میکروسیستم Leica) (20 درجه سانتیگراد ،> 90٪ رطوبت نسبی). داده ها با استفاده از نرم افزار جمع آوری داده های خودکار EPU نصب شده بر روی میکروسکوپ الکترونی انتقال گیرنده Titan Krios که در 300 کیلو ولت کار می کند بدست آمدند و با Falcon3 Direct Electron Detector که در حالت شمارش کار می کند ، نصب شدند. دوز بیش از 30 فریم خام تکه تکه شد و بیش از 60 ثانیه با قرار گرفتن در معرض 0.8 پوند s 0.sup> – / پیکسل / ثانیه برای قرار گرفتن در معرض کل 42 ~ e / Å جمع آوری شد. 2 . فریم های فردی هم تراز و با دوز وزن بودند. p>

عملکرد انتقال کنتراست (CTF) با استفاده از بسته GCTF برآورد شد [ 80 ]. ذرات با استفاده از عملکرد Laplacian-Gaussian در RELION 3 انتخاب شدند [ 81 ]. این ذرات به cryoSparc [ 82 ] وارد شد ، جایی که طبقه بندی 2D انجام شد و کلاسهای 2D انتخاب شده به نمایه نمایش های مختلف مجتمع برای ذرات مبتنی بر الگو استفاده شد. چیدن پس از طبقه بندی های بیشتر 2D برای حذف آشغال ، بازسازی و طبقه بندی با استفاده از تقارن C1 انجام شد. یک مدل ab նախաձեռնی em> با سه آنتی بادی Fabs متقارن به اصلاح کننده HIV-1 Env مشخص شد ، و با استفاده از تقارن C3 در برابر پشته تمیز ذرات برای به دست آوردن نقشه وضوح 4.2 تصفیه شد. وضوح نقشه کلی مطابق معیار استاندارد طلای FSC 0.143 گزارش شده است. p>

مناسب مدل Cryo-EM

متناسب با برش HIV-1 و Fab به Cryo-EM بازسازی شد نقشه ها با استفاده از UCSF Chimera [ 83 ] انجام شد. ساختار صاف کننده BG505 SOSIP (PDB ID: 5YFL) برای برش متناسب استفاده شد و مختصات بالغ CH235.12 بالغ (PDB ID: 5F96) برای تعبیه فاب مورد استفاده قرار گرفت. توالی با تریم CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 و CH235 UCA2 به ترتیب با استفاده از Coot [ 84 ] جایگزین شد. مختصات بیشتر با استفاده از Rosetta [ 85 ] با چگالی الکترونی مناسب بود ، و پس از آن یک فرآیند تکرار شونده دستی با استفاده از Coot و پالایش فضای واقعی در Phenix [ 86 ] با دور نهایی پالایش روزتا. برای بررسی هندسه و ارزیابی از Molprobity [ 87 ] و EMRinger [ 88 ] استفاده شد. ساختارها در هر مرحله تکرار گلیکان ها با استفاده از pdb-care [ 89 ] تأیید شدند. ارقام در UCSF Chimera و PyMOL (سیستم گرافیکی مولکولی PyMOL ، نسخه 2.0 شرودینگر ، LLC) تولید شد. همبستگی متقابل متناسب با نقشه با استفاده از ویژگی متناسب با نقشه در UCSF Chimera محاسبه شد. منحنی های FSC نقشه به مدل با استفاده از EMAN2 تولید شدند. وضوح محلی نقشه های cryo-EM با استفاده از RELION 3. تعیین شد

اطلاعات پشتیبانی

S1 شکل. منحنی های خنثی سازی برای UCA ها و واسطه های CH103 و CH235.

روشهای خنثی سازی با ویروس های Env-pseudoyped تهیه شده در سلولهای 293T یا 293S / GnT1 انجام شد. در سلول های TZM-bl همانطور که در روش ها توضیح داده شده است. ضریب رقت (به عنوان مثال ، 3 برابر یا 5 برابر) و دامنه غلظت bnAb ارزیابی شده بسته به قدرت ترکیب ویروس / آنتی بادی متفاوت بود و گاهی اوقات فاکتورها و محدوده های مختلف رقت در سنجش های مکرر مورد بررسی قرار گرفت. برای بدست آوردن منحنی هایی که هنگام عبور از خنثی سازی 50٪ برای اندازه گیری دقیق مقادیر IC50 ، خطی بودند ، انجام شد. هنگامی که چندین سنجش انجام شد ، از میانگین IC50 در شکل 1 استفاده شد. CH103_IA_9_4A زودترين واسطه اين خاندان آزمايش شده است در حالي كه CH103_AI_4_4A جديدترين است. به همین ترتیب ، CH235_I4_v2_4A سریعترین واسطه است در حالی که CH235_I1_v2_4A آخرین واسطه آزمایش شده است. (الف) CH103_UCA_4A؛ (ب) CH103_IA_9_4A؛ (ج) CH103_IA_8_4A؛ (د) CH103_IA_7_4A؛ (ث) CH103_IA_6_4A؛ (F) CH103_IA_5_4A؛ (G) CH103_IA_4_4A؛ (H) CH235 UCA2؛ (من) CH235_I4_v2_4A؛ (J) CH235_I3_v2_4A؛ (K) CH235_I1_v2_4A.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.s005 p>

(PDF)

S2 شکل. نوترکیب تثبیت شده CH505 SOSIP gp140s پاکت تریمری را تشکیل می دهد و مشخصات آنتی ژنی پاکت را در ترکیب بسته تشکیل می دهد.

(A) میانگین کلاس دو بعدی نماینده لکه منفی تصاویر میکروسکوپ الکترونی از پروتئین CH505 SOSIP gp140. تغییرات اسید آمینه وارد شده به دنباله پاکت منتقل شده / بنیانگذار CH505 در بالا هر تصویر نشان داده شده است. (ب) آنتی ژن از هر نوع CH505 SOSIP gp140 که توسط تداخل سنج بیو لایه (BLI) تعیین می شود. مقادیر پاسخ های الزام آور در nm هستند. GnT1 پروتئین های تولید شده در سلول های 293S GnT1 را برای غنی سازی برای Man 5 GlcNac 2 نشان می دهد.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.s006 p>

(PDF)

S3 شکل. سینتیک اتصال SPR اتصال CH235 UCA2 به تریم های CH505TF SOSIP والدین و جهش یافته تولید شده در سلول های 293F یا 293S GnT1-. h3>

داده های وابستگی SPR آشکار K D با ثابت بودن نرخ به دست آمده از آنالیزهای برازش منحنی به 1: 1 مدل لانگمیر برای اتصال پروتئین های SOSIP trimeric به عنوان آنالیت به CH235 UCA2 mAb بی حرکت در ضد IgG Fc mAb بر روی تراشه سنسور. غلظت پروتئین SOSIP در هر منحنی اتصال داده شده است. داده های جدول نشان داده شده نتیجه دو اندازه گیری مستقل توسط تجزیه و تحلیل SPR است.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.s007 p>

(PDF)

S4 شکل. جزئیات ساختاری برای بازسازی Cryo-EM از CH235 UCA2 محدود به غنی شده با Man5 CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664.

(A) میکروگراف نماینده. (ب) میانگین های کلاس 2D اولیه که نشان دهنده ی مجتمع های بزرگتر مربوط به برش FAB به Env است که با نقاط قرمز مشخص شده اند ، و مجتمع های کوچکتر مربوط به یک Fab Fab تنها که به یک قطعه Env ، احتمالاً gp120 ، با نقاط آبی مشخص شده است. ج) میانگین کلاس 2D نهایی. (د) مدل Ab initio . (E) نقشه تصفیه شده با شروع از ab initio مدل تولید شده و پالایش آن در برابر پشته ای از ذرات تمیز و استفاده از تقارن C3. (F) منحنی همبستگی پوسته فوریه. خط نقطه دار FSC 0.143 را نشان می دهد.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.s008 p>

(PDF)

S5 شکل. وضوح نقشه محلی برای بازسازی Cryo-EM از CH235 UCA2 محدود به غنی سازی Man5 با CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664.

(A) رنگ وضوح محلی کدگذاری و ترسیم بر روی سطح نقشه (BE) نمایش بزرگنمایی مناطق Loop V5 و Loop D از HIV-1 Env gp120 و آنتی بادی محدود CH235 UCA2. مش آبی نشانگر چگالی تجربی Cryo-EM است ، و مدل مناسب زیربنایی در نمایش کارتون و چوب نشان داده شده است. p>

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.s009 p>

(PDF)

S6 شکل. مقایسه ساختار CH235 UCA2 محدود به غنی سازی Man5 با CH505TF.N279K.G458Y.SOSIP.664 با CH235.12 محدود به HIV-1 clade A / E 93TH057 gp120 (PDB ID 5F96).

(A و B) پوشش دامنههای بیرونی gp120 (خاکستری) برای نشان دادن زاویههای رویکرد آنتی بادی CH235 UCA2 و CH235.12. (CH) مقایسه اتصال CH235 UCA2 و CH235.12 به عناصر مهم در gp120 ، با حلقه اتصال CD4 نشان داده شده در C و D ، حلقه D نشان داده شده در E و F ، و حلقه V5 نشان داده شده در G و H. (I) ساختار CH235 UCA2 محدود. (J) نمای بزرگنمایی را نشان می دهد که یک پوشش از gp120 از PDB ID 5FYL بر روی پروموت کواترنر. تریمر SOSIP در ساختار بلوری 5FYL در سلولهای 293F تولید شد. Glycans 301 و 262 از پروموتور کواترنر ، هنگامی که از نظر شکل پیچیده ای هستند ، نزدیک به CH235 UCA2 را نشان می دهند.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008026.s010 p>

(PDF)

تشکرها

ما با مهربانی اذعان می کنیم دنیس برتون ، میشل نوسنزویگ ، مارک کانورز ، داوید کورتی ، سوزان زولا- پازنر و میروسلاو K. گورنی برای تهیه بسیاری از آنتی بادی های مونوکلونال مورد استفاده در این مطالعه. ما از اشلی تراما و جیووانا هرناندز برای تهیه آنتی بادی در موسسه واکسن انسانی دوک تشکر می کنیم. داده های Cryo-EM در مرکز ابزار دقیق ابزار مشترک در دانشگاه دوک به عنوان بخشی از کنسرسیوم میکروسکوپ مولکولی جمع آوری شد. کیفیت تصویر Cryo-EM در طول جمع آوری داده ها با استفاده از روالهایی که توسط A. Bartesaghi تهیه شده بود ، در پرواز مورد بررسی قرار گرفت. برخی از مطالعات اولیه Cryo-EM در مرکز میکروسکوپ الکترونی الکترونیکی سیمونز و منابع ملی میکروسکوپ مولکولی خودکار که در مرکز زیست شناسی ساختاری نیویورک واقع شده است انجام شد.

References

  1. 1.              Kwong PD ، Mascola JR و Nabel GJ. آنتی بادی ها به طور گسترده خنثی می شوند و جستجوی واکسن HIV ‑ 1: پایان آغاز. Nat Rev Immunol. 2013؛ 9: 693-701.
  2. 2.              Sok D ، و Burton DR. پیشرفت های اخیر در خنثی سازی گسترده آنتی بادی های HIV. ایمونولوژی طبیعت. 2018؛ 19: 1179–1188. pmid: 30333615
  3. 3.              Kwong PD، Doyle ML، Casper DJ، Cicala C، Leavitt SA، Majeed S. et al. HIV-1 از خنثی سازی آنتی بادی با واسطه پوشش سازه ای از سایت های اتصال گیرنده جلوگیری می کند. طبیعت 2002؛ 420: 678-682. pmid: 12478295
  4. 4.              Wei X، Decker JM، Wang S، Hui H، Kappes JC، Wu X، et al. خنثی سازی آنتی بادی و فرار توسط HIV-1. طبیعت 2003؛ 422: 307-312. pmid: 12646921
  5. 5.              Jardine JG، Ota T، Sok D، Pauthner M، Kulp DW، Kalyuzhniy O، et al. آغازگر یک واکنش آنتی بادی به طور گسترده خنثی به HIV-1 با استفاده از یک ایمونوژن با هدف قرار دادن میکروب. علوم پایه. 2015؛ 349: 156–161. pmid: 26089355
  6. 6.              McGuire AT، MD Grey، Dosenovic P، Gitlin AD، Freund NT، Peteren J، et al. ایمونوژنهای خاص اصلاح شده Env ، پیش سازهای سلول B را در خنثی کردن آنتی بادی های HIV-1 در موش های تراریخته فعال می کنند. نات ارتباط 2016؛ 7: 10618. pmid: 26907590
  7. 7.              هاینز BF ، Fleming J ، خیابان Clair EW ، Katinger H ، Stiegler G ، Kunert R، و همکاران . خودکارآمدی چندشخصی کاردیولیپین در دو آنتی بادی HIV-1 به طور گسترده خنثی. علوم پایه. 2005؛ 308: 1906-1908. pmid: 15860590
  8. 8.              هاینز BF ، و Verkoczy L. AIDS / HIV. کنترل میزبان آنتی بادی های خنثی کننده HIV. علوم پایه. 2014؛ 344: 588-589. pmid: 24812389
  9. 9.              Kelsoe G و Haynes BF. کنترل میزبان ویروس HIV به طور گسترده ای باعث خنثی سازی آنتی بادی می شود. بررسی ایمنی. 2017؛ 275: 79-88. pmid: 28133807
  10. 10.              کلین اف ، موکته H ، دوزنوویچ پ ، شید جی اف ، شارف ل ، و نوسنزویگ MC. آنتی بادی در ساخت و درمان واکسن HIV-1. علوم پایه. 2013؛ 341: 1199-1204. pmid: 24031012
  11. 11.              Kwong PD و Mascola JR. آنتی بادی های انسانی که HIV-1 را خنثی می کنند: شناسایی ، ساختارها و آنتوژن های سلول B. مصونیت 2012؛ 37: 412-425. pmid: 22999947
  12. 12.              Bricault CA، Yusim K، Seaman MS، Yoon H، Theiler J، George EE، et al. HIV-1 امضای آنتی بادی خنثی کننده و کاربرد آن در طراحی واکسن با هدف اپی توپ. میزبان سلول و میکروب. 2019؛ 25: 59–72.
  13. 13.              Pauthner M، Havenar-Daughton C، Sok D، Nkolola JP، Bastidas R، Boopathy AV، et آل استخراج پاسخ های مقاوم به آنتی بادی 2 ردیف قوی در نخبگان غیر انسانی توسط ایمن سازی تریمر پاکت HIV با استفاده از روشهای بهینه شده مصونیت 2017؛ 46: 1073-1088. pmid: 28636956
  14. 14.              Saunders KO، Nicely NI، Wiehe K، Bonsignori M، Meyerhoff RR، Parks R، et al. استخراج واکسن آنتی بادی های خنثی کننده وابسته به مانوز بالا در برابر اپی توپ V3-glycan به طور گسترده خنثی در اشیای غیر انسانی. نمایندگی موبایل 2017؛ 18: 2175 – 2188. pmid: 28249163
  15. 15.              Xu K، Acharya P، Kong R، Cheng C، Chuang GY، Liu K، et al. طراحی واکسن مبتنی بر اپی توپ باعث تولید آنتی بادی های پپتیدی به همجوشی می شود که گونه های متنوعی از HIV-1 را خنثی می کند. Nat Med. 2018؛ 6: 857-867.
  16. 16.              هاینز BF ، و Mascola JR. تلاش برای واکسن HIV مبتنی بر آنتی بادی. Immunol Rev. 2017؛ 275: 5-10. pmid: 28133795
  17. 17.              Kwong PD و Mascola JR. واکسن های HIV-1 بر اساس شناسایی آنتی بادی ، آنتوژنی سلول B و ساختار اپی توپ. مصونیت 2018؛ 48: 855-871. pmid: 29768174
  18. 18.              جاردین جی ، جولیان جی پی ، منیس س ، اوتا تی ، کالیوژنی ا ، مک گایر A ، و همکاران. طراحی سیستم ایمنی اچ آی وی عقلانی برای هدف قرار دادن گیرنده های سلولهای ژنتیکی خاص. علوم پایه. 2013؛ 340 (6133): 711–6. بعد از ظهر: 23539181؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3689846.
  19. 19.              McGuire AT، Hoot S، Dreyer AM، Lippy A، Stuart A، Cohen KW، و همکاران. مهندسی پروتئین پاکت اچ آی وی برای فعال کردن گیرنده های سلول ژرمینال B آنتی بادی های ضد اتصال CD4 به طور گسترده خنثی. مجله طب تجربی. 2013؛ 210 (4): 655-63. بعد از ظهر: 23530120؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3620356.
  20. 20.              Sliepen K ، Medina-Ramírez M، Yasmeen A، Moore JP، Klasse PJ، and Sanders RW. اتصال به پیش سازهای میکروبی استنباط شده از خنثی سازی آنتی بادی های HIV-1 به خنثی سازی پاکت های بومی مانند. ویروس شناسی 2015؛ 486: 116-120. pmid: 26433050
  21. 21.              de Taeye SW، Moore JP، and Sanders RW (2016) طراحی و ایمن سازی پاکت HIV-1 پاکت استراتژی برای القاء آنتی بادی های گسترده به طور گسترده ای گرایش در ایمونولوژی. 37 ، 221–232. pmid: 26869204
  22. 22.              Bale S، Martiné A، Wilson R، Behrens AJ، Le Fourn V، de Val N. et آل مستقل از جداکننده HIV-1 از رده های سلولی CHO ، آنتی بادی های خنثی کننده سطح 2 اتولوگ قوی را استخراج می کنند. ایمونول جلو 2018؛ 9: 1116. pmid: 29881382
  23. 23.              de Taeye SW، Ozorowski G، Torrents de la Pen˜ a A، Guttman M، Julien JP، ون دن Kerkhof TL ، و همکاران. ایمنی سوزننده پاکت HIV-1 تثبیت شده با کاهش قرار گرفتن در معرض اپی توپ های غیر خنثی. سلول. 2015؛ 163: 1702-11715. pmid: 26687358
  24. 24.              جویس MG ، جورجیف IS ، یانگ Y ، Druz A ، Geng H ، Chuang GY ، و دیگران. پیش فرض محلول بسته های DS-SOSIP.664-Env از سویه های متنوع HIV-1 را بست. نمایندگی موبایل 2017؛ 21: 2992-3002. pmid: 29212041
  25. 25.              مدینه ‑ رامرز م. ، گارسس ، اسکولانو A ، Skog P ، د Taeye SW ، اخلاقی ‑ سانچز شناسه و همکاران طراحی و ساختار کریستالی یک اصلاح کننده پاکت HIV-1 بومی که درگیر چندین پیش ساز آنتی بادی خنثی کننده در داخل بدن است. J Exp Med. 2017؛ 214: 2573-252590. pmid: 28847869
  26. 26.              Sanders RW، Derking R، Cupo A، Julien JP، Yasmeen A، de Val N، et al . صاف کننده و حل شده HIV-1 Env نسل بعدی ، BG505 SOSIP.664 gp140 ، نسل های مختلفی را برای آنتی بادی های خنثی کننده اما نه خنثی کننده بیان می کند. PLoS Pathog. 2013؛ سپتامبر 9 (9): e1003618. pmid: 24068931
  27. 27.              تورنتهای دو لا پنه A ، جولیان جی پی ، د Taeye SW ، گارسس اف ، گوتمن م ، اوزوروفسکی G ، و همکاران بهبود ایمنی تریمرهای پاکت HIV-1 مشابه بومی با استفاده از فرضیه سوء استفاده. نمایندگی موبایل 2017؛ 20: 1805-1817. pmid: 28834745
  28. 28.              Munro JB، Gorman J، Ma X، Zhou Z، Arthos J، Burton DR، et al. پویایی سازه ای از اصلاح کننده های HIV-1 Env روی سطح ویروس های بومی. علوم پایه. 2014؛ 346: 759-763. pmid: 25298114
  29. 29.              LaBranche CC، McGuire AT، MD Grey، Behrens S، Chen X، Zhou T، et al. اصلاحات گلیکای پاکت HIV-1 که اجازه خنثی سازی توسط کلاس VRC01 را برگردانده با میکروب آنتی بادی ها را خنثی می کند. PLoS Pathog. 2018؛ 14 (11): e1007431. pmid: 30395637
  30. 30.              Liao HX، Lynch R، Zhou T، Gao F، Alam SM، Boyd SD، et al. تکامل آنتی بادی HIV-1 و ویروس بنیانگذار کاملاً خنثی کننده. طبیعت 2013؛ 496 (7446): 469-76. بعد از ظهر: 23552890؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3637846.
  31. 31.              Bonsignori M، Zhou T، Sheng Z، Chen L، Gao F، Joyce MG، et al. مسیر بلوغ از Germline به گسترده HIV-1 Neutralizer از آنتی بادی CD4-Mimic. سلول. 2016؛ 165 (2): 449-63. بعد از ظهر: 26949186؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4826291
  32. 32.              Gao F، Bonsignori M، Liao HX، Kumar A، Xia SM، Lu X، et al. همکاری سلول های B سلول در القاء آنتی بادی های HIV-1 به طور گسترده خنثی سلول. 2014؛ 158 (3): 481-91. بعد از ظهر: 25065977؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4150607.
  33. 33.              Zhou T، Doria-Rose NA، Cheng C، Stewart-Jones GBE، Chuang GY، Chambers M ، و همکاران تعیین میزان تأثیر سپر HIV-1-glycan در استخراج آنتی بادی. نمایندگی موبایل 2017؛ 19: 719-732. pmid: 28445724
  34. 34.              Blattner C، Le JH، Sliepen K، Derking R، Falkowska E، de la Pena AT، و آل تركیبات ساختاری یك اپی توپ به کواترنر ، وابسته به رخ در رابط gp41-gp120 در تریمرهای دست نخورده HIV-1 Env. مصونیت 2014؛ 40 (5): 669-80. بعد از ظهر: 24768348؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4057017.
  35. 35.              Falkowska E، Le KM، Ramos A، Doores KJ، Lee JH، Blattner C، et al. آنتی بادی های HIV به طور گسترده ای خنثی کننده ، یک اپی توپ وابسته به گلیکان را در ترکیب پیش احتمالی gp41 در برش های پاکت شکاف تعریف می کنند. مصونیت 2014؛ 40 (5): 657-68. بعد از ظهر: 24768347؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4070425.
  36. 36.              ریوز PJ ، Callewaert N ، Contreras R ، Khorana HG. ساختار و عملکرد در رودوپسین: بیان سطح بالایی رودوپسین با N-گلیکوزیلاسیون محدود و همگن توسط N- استیل گلوکزوزامینیل ترانسفراز- القایی تتراسایکلین ناشی از I- منفی HEK293S رده سلولی پستاندار مجموعه مقالات آکادمی ملی علوم ایالات متحده آمریکا. 2002؛ 99 (21): 13419–24. بعد از ظهر: 12370423؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC129688.
  37. 37.              Binley JM، Ban YE، Crooks ET، Eggink D، Osawa K، Schief WR، et al. نقش کربوهیدراتهای پیچیده در عفونت ویروس کمبود ایمنی انسان نوع 1 و مقاومت در برابر خنثی سازی آنتی بادی. مجله ویروس شناسی. 2010؛ 84 (11): 5637-55. بعد از ظهر: 20335257؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC2876609.
  38. 38.              Crooks ET، Grimley SL، Cully M، Osawa K، Dekkers G، Saunders K، et al. Glycoengineering HIV-1 En باعث افزایش خنثی کننده قدرت آنتی بادی ، وسعت و اشباع گلیکان های “فوق شارژ” و “ترکیبی” می شود. پاتوژن های PLoS. 2018؛ 14 (5): e1007024. Epub 2018/05/03. بعد از ظهر: 29718999؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC5951585.
  39. 39.              Wyatt R، and Sodroski J. گلیکوپروتئینهای پاکت HIV-1: fusogens ، آنتی ژن ها ، و ایمنی. علوم پایه. 1998؛ 280: 1884 – 1888. pmid: 9632381
  40. 40.              Montefiori DC، Roederer M، Morris L، and Seaman MS. لایه های خنثی سازی HIV-1. Curr Opin HIV HIV. 2018؛ 13: 1–9.
  41. 41.              Diskin R، Klein F، Horwitz JA، Halper-Stromberg A، Sather DN، Marcovecchio PM، et آل محدود کردن مسیرهای HIV-1 برای فرار با استفاده از آنتی بادیهای ضد HIV-1 که به صورت عقلانی طراحی شده اند. J Exp Med. 2013؛ 210: 1235–1249. pmid: 23712429
  42. 42.              کلین اف ، هالپر استرومبرگ الف ، هورویتز جی. ، گروول ح ، شید JF ، بورنازوس ، و آل HIV درمان با ترکیبی از آنتی بادی های خنثی کننده در موش های انسانی. طبیعت 2012؛ 492: 118–122 pmid: 23103874
  43. 43.              لی Y، O’Dell S، Walker LM، Wu X، Guenaga J، Feng Y، et آل مکانیسم خنثی سازی توسط آنتی بادی مونوکلونال HIV-1 به طور گسترده خنثی کننده VRC01. مجله ویروس شناسی. 2011؛ 85 (17): 8954-67. بعد از ظهر: 21715490؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3165784.
  44. 44.              Lynch RM، Wong P، Tran L، O’Dell S، Nason MC، Li Y، et آل تناسب اندام HIV-1 همراه با فرار از کلاس VRC01 سایت اتصال CD4 آنتی بادی های خنثی کننده. مجله ویروس شناسی. 2015؛ 89 (8): 4201–13. بعد از ظهر: 25631091؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4442379.
  45. 45.              Saunders KO، Verkoczy LK، Jiang C، Zhang J، Parks R، Chen H، et al. القاء واکسن آنتی بادی های خنثی لایه 2 HIV-1 در مدل های حیوانی. نمایندگی موبایل 2017؛ 21: 3681-3690. pmid: 29281818
  46. 46.              ژو T ، جورجیف اول ، وو ایکس ، یانگ ZY ، دای K ، فینزی A ، و دیگران. اساس ساختاری برای خنثی سازی گسترده و قوی HIV-1 توسط آنتی بادی VRC01. علوم پایه. 2010؛ 329: 811-817. pmid: 20616231
  47. 47.              Zhou T، Zhu J، Wu X، Moquin S، Zhang B، Acharya P، et al. تجزیه و تحلیل Multidonor عناصر ساختاری ، تعیین کننده های ژنتیکی و مسیر بلوغ را برای خنثی سازی HIV-1 توسط آنتی بادی های کلاس VRC01 نشان می دهد. مصونیت 2013؛ 39: 245-58. pmid: 23911655
  48. 48.              Zhou T، Lynch RM، Chen L، Acharya P، Wu X، Doria-Rose NA، et آل صفحه‌ی ساختاری آنتی بادیهای خنثی HIV-1 که در 14 اهداکننده جای خود را به جای CD4 برده اند. سلول. 2015؛ 161: 1280–1292. pmid: 26004070
  49. 49.              Wu X، Zhou T، Zhu J، Zhang B، Georgiev I، Wang C، et al. تکامل آنتی بادی های خنثی HIV-1 متمرکز شده توسط ساختارها و توالی عمیق متمرکز شده است. علوم پایه. 2011؛ 333: 1593-1602. pmid: 21835983
  50. 50.              Liu Q، Acharya P، Dolan MA، Zhang P، Guzzo C، Lu J، et al. تماس کواترنر در تعامل اولیه CD4 با اصلاح کننده پاکت HIV-1. Nat Struct Mol Biol. 2017؛ 24: 370-378. pmid: 28218750
  51. 51.              Gorman J، Soto C، Yang MM، Davenport TM، Guttman M، Bailer RT، et al. ساختار HIV-1 Env V1V2 با آنتی بادی های خنثی کننده ، مشترکاتی را نشان می دهد که طراحی واکسن را ممکن می سازد. Nat Struct Mol Biol 2016؛ 23: 81-90. pmid: 26689967
  52. 52.              Behrens AJ، Vasiljevic S، Pritchard LK، Harvey DJ، Andev RS، Krumm SA، و دیگران. ترکیبات و اثرات آنتی ژنتیکی سایتهای گلیکان جداگانه یک پاکت گلیکوپروتئین پاکسازی HIV-1. گزارشات سلولی 2016؛ 14 (11): 2695-706. بعد از ظهر: 26972002؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4805854.
  53. 53.              Cao L، Diedrich JK، Kulp DW، Pauthner M، He L، Park SR، et al. تجزیه و تحلیل گلیکوزیلاسیون N-اختصاصی سایت جهانی گلیکوپروتئین پاکت HIV. ارتباطات طبیعت 2017؛ 8: 14954. بعد از ظهر: 28348411؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC5379070.
  54. 54.              وو ایکس ، یانگ ZY ، لی Y ، Hogerkorp CM ، Schief WR ، Seaman MS و همکاران. طراحی منطقی پاکت ، آنتی بادی های مونوکلونال انسانی را به طور گسترده ای خنثی می کند تا HIV-1. علوم پایه. 2010؛ 329: 856-861. pmid: 20616233
  55. 55.              Kong R، Xu K، Zhou T، Acharya P، Lemmin T، Liu K، et al. پپتید فیوژن HIV-1 به عنوان محلی برای آسیب پذیری در خنثی کردن آنتی بادی. علوم پایه. 2016؛ 352: 828-833. pmid: 27174988
  56. 56.              هوانگ جی ، افک ج ، Laub L ، Louder MK ، Doria-Rose NA ، Longo NS ، و آل خنثی سازی گسترده و قدرتمند HIV-1 توسط یک آنتی بادی انسانی اختصاصی gp41. طبیعت 2012؛ 491 (7424): 406–12. بعد از ظهر: 23151583؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4854285.
  57. 57.              هوانگ جی ، کانگ BH ، ایشیا E ، ژو تی ، گریسمان تی ، شنگ ز ، و دیگران. شناسایی یک آنتی بادی CD4- محل اتصال به HIV که دامنه خنثی سازی نزدیک به پان را تکامل داده است. مصونیت 2016؛ 45 (5): 1108-221. بعد از ظهر: 27851912.
  58. 58.              Scheid JF، Mouquet H، Ueberheide B، Diskin R، Klein F، Oliveira TY، و دیگران. توالی و همگرایی ساختاری آنتی بادی های گسترده و قدرتمند HIV که اتصال CD4 را تقلید می کنند. علوم پایه. 2011؛ 333 (6049): 1633-7. بعد از ظهر: 21764753؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3351836.
  59. 59.              Mouquet H، Scharf L، Euler Z، Liu Y، Eden C، Scheid JF، و دیگران. به رسمیت شناختن N- گلیکان از نوع پیچیده با آنتی بادی های HIV به طور گسترده خنثی. مجموعه مقالات آکادمی ملی علوم ایالات متحده آمریکا. 2012؛ 109 (47): E3268-77. بعد از ظهر: 23115339؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3511153.
  60. 60.              Bonsignori M، Montefiori DC، Wu X، Chen X، Hwang KK، Tsao CY، et al. دو ویژگی آنتی بادی کاملاً خنثی کننده از نژادهای کلونال متفاوت در یک اهدا کننده آلوده به HIV-1: پیامدهای طراحی واکسن. مجله ویروس شناسی. 2012؛ 86 (8): 4688–92. بعد از ظهر: 22301150؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3318651.
  61. 61.              ویلیامز LD ، افک ج ، شوچل س ، مک دانیل جی آر ، لو ایکس ، زیبا NI و همکاران. آنتی بادی های خنثی و HIV گسترده و گسترده در سلول های B و پلاسما حافظه. Science Immunology 2017؛ 2 (7): eaal2200. pmid: 28783671
  62. 62.              Corti D، Langedijk JP، Hinz A، Seaman MS، Vanzetta F، Fernandez-Rodriguez BM، et آل تجزیه و تحلیل پاسخ سلول های B حافظه و جداسازی آنتی بادی های مونوکلونال رمان با وسعت خنثی کننده از افراد آلوده به HIV-1 PloS یکی. 2010؛ 5 (1): e8805. بعد از ظهر: 20098712؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC2808385.
  63. 63.              Burton DR، Pyati J، Koduri R، Sharp SJ، Thornton GB، Parren PW، و دیگران. خنثی سازی موثر جدایه های اولیه HIV-1 توسط یک آنتی بادی مونوکلونال نوترکیب انسانی. علوم پایه. 1994؛ 266 (5187): 1024–7. بعد از ظهر: 7973652.
  64. 64.              سوک د ، ون گیلز ام جی ، پوتنر م ، جولیان جی پی ، سای-فرانسیسکو KL ، هسعه جی ، و همکاران اصلاح کننده پاکت HIV نوترکیب آنتی بادی های وابسته به کواترنر را هدف قرار می دهد که بر روی اوج تریمر هدف قرار می گیرد. مجموعه مقالات آکادمی ملی علوم ایالات متحده آمریکا. 2014؛ 111 (49): 17624–9. بعد از ظهر: 25422458؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC4267403.
  65. 65.              Walker LM، Huber M، Doores KJ، Falkowska E، Pejchal R، Julien JP، et al. پوشش خنثی سازی گسترده ویروس HIV توسط چندین آنتی بادی بسیار قوی. طبیعت 2011؛ 477 (7365): 466-70. بعد از ظهر: 21849977؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3393110.
  66. 66.              Gorny MK، Williams C، Volsky B، Revesz K، Cohen S، Polonis VR، et al. آنتی بادی های مونوکلونال انسانی خاص برای اپی توپ های حساس به ساختار V3 خنثی شده جدا شده اولیه HIV-1 از کلادهای مختلف. جی ویرول 2002؛ 76: 9035-9045. pmid: 12186887
  67. 67.              Gorny MK، Revesz K، Williams C، Volsky B، Louder MK، Anyangwe CA و دیگران. حلقه V3 بر روی سطح بیشتر ویروسهای نقص ایمنی بدن انسان نوع 1 جدا شده است و به عنوان اپی توپ خنثی سازی خدمت می کند. جی ویرول 2004؛ 78: 2394–2404. pmid: 14963135
  68. 68.              Gorny MK، Williams C، Volsky B، Revesz K، Wang XH، Burda S، et al. فعالیت خنثی کننده متقابل کلاد آنتی بادی های مونوکلونال ضد V3 انسانی ناشی از سلول های افراد آلوده به کلادهای غیر B از HIV-1. جی ویرول 2006؛ 80: 6865-6872. pmid: 16809292
  69. 69.              Gorny MK، Wang XH، Williams C، Volsky B، Revesz K، Witover B، et al. استفاده ترجیحی از بخش ژن VH5-51 توسط پاسخ ایمنی انسان به کد برای آنتی بادی ها در برابر دامنه V3 HIV-1. Mol Immunol. 2009؛ 46: 917-926. pmid: 18952295
  70. 70.              Gorny MK ، Xu JY ، Karwowska S ، Buchbinder A و Zolla-Pazner S. Repertoire خنثی سازی آنتی بادی های مونوکلونال انسانی خاص برای دامنه V3 HIV-1 gp120. جی ایمونول 1993؛ 150: 635–643. pmid: 7678279
  71. 71.              Gorny MK، VanCott TC، Hioe C، Israel Z، Michael NL، Conley AJ، و دیگران. آنتی بادی های مونوکلونال انسانی به حلقه V3 HIV-1 با واکنش متقابل درون و درون لایه. جی ایمونول 1997؛ 159: 5114-5122. pmid: 9366441
  72. 72.              Nyambi PN، Gorny MK، Bastiani L، van der Groen G، Williams C، and Zolla-Pazner نقشه برداری از اپی توپ ها که در معرض ویروس کمبود ایمنی بدن انسان دست نخورده نوع 1 (HIV-1) قرار دارند: یک استراتژی جدید برای بررسی ارتباط ایمنی اچ آی وی-1. جی ویرول 1998؛ 72: 9384–9391. pmid: 9765494
  73. 73.              جفز SA ، Gorny MK ، ویلیامز سی ، ریوز K ، Volsky B ، Burda S ، و همکاران. خصوصیات آنتی بادی های مونوکلونال انسانی انتخاب شده با یک حلقه بیش از حد نوترکیب HIV-1 (IIIB) gp120 حذف شده. ایمونول برگ 2001؛ 79: 209 – 213. pmid: 11600200
  74. 74.              Zolla-Pazner S، O’Leary J، Burda S، Gorny MK، Kim M، Mascola J ، و McCutchan F. سروتیپینگ ویروس نقص ایمنی اولیه انسانی نوع 1 جدا شده از مناطق مختلف جغرافیایی با فلوسیتومتری. جی ویرول 1995؛ 69: 3807-3815. pmid: 7745728
  75. 75.              Posner MR، Hideshima T، C Cannon T، Mukherjee M، Mayer KH، and Byrn RA. آنتی بادی مونوکلونال انسانی IgG که با HIV-1 / gp120 واکنش نشان می دهد ، اتصال ویروس به سلول ها را مهار می کند و عفونت را خنثی می کند. جی ایمونول 1991؛ 146: 4325-4332 pmid: 1710248
  76. 76.              تانگ ح ، رابینسون جی. ، گناناکاران S ، لی م ، روزنبرگ ES ، پرز ال جی و همکاران. اپی توپ بلافاصله زیر پایه حلقه V3 gp120 به عنوان هدف برای پاسخ اولیه آنتی بادی خنثی اتولوگ در دو فرد آلوده به زیر گروه HIV-1. مجله ویروس شناسی. 2011؛ 85 (18): 9286-99. بعد از ظهر: 21734041؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3165744.
  77. 77.              Montefiori DC. اندازه گیری خنثی سازی HIV در یک آزمایش ژن گزارشگر لوسیفراز. روشهای زیست شناسی مولکولی. 2009؛ 485: 395-405. بعد از ظهر: 19020839.
  78. 78.              Eggink D، Melchers M، Wuhrer M، van mantfort T، Dey AK، Naaijkens BA، et al . عدم وجود N-glycans های پیچیده بر روی گلیکوپروتئین های پاکت HIV-1 ، ترکیب پروتئین و عملکرد ورودی را حفظ می کند. ویروس شناسی 2010؛ 401 (2): 236-47. بعد از ظهر: 20304457؛ PubMed PMCID مرکزی: PMC3776475.
  79. 79.              Alam SM، Liao HX، Tomaras GD، Bonsignori M، Tsao CY، Hwang KK، et al. آنتی ژن و ایمنی واکسن RV144 واکسن AIDSVAX کلون E ایمونوژن پاکت نامه با حذف ترمینال gp120 N anced افزایش یافته است. جی ویرول 2013؛ 87: 1554-151568. pmid: 23175357
  80. 80.              Zhang K. Gctf: تعیین و تصحیح CTF در زمان واقعی. J Struct Biol. 2016؛ 193: 1–12. pmid: 26592709
  81. 81.              Zivanov J، Nakane T، Forsberg BO، Kimanius D، Hagen WJ، Lindahl E، and Scheres SH . ابزارهای جدید برای تعیین خودکار ساختار Cryo-EM با وضوح بالا در RELION-3. الیف 2018؛ pii: e42166. pmid: 30412051
  82. 82.              Punjani A، Rubinstein JL، Fleet DJ، and Brubaker MA. cryoSPARC: الگوریتم هایی برای تعیین سریع ساختار Cryo-EM بدون نظارت – سایپرز ، باشگاه دانش روش های Nat. 2017؛ 14: 290–296. pmid: 28165473
  83. 83.              Pettersen EF، Goddard TD، Huang CC، Couch GS، Greenblatt DM، Meng EC و Ferrin TE . UCSF Chimera system یک سیستم تجسم برای تحقیقات و تحلیل اکتشافی. J Comput Chem. 2004؛ 25: 1605 – 1612. pmid: 15264254
  84. 84.              Emsley P ، Lohkamp B ، Scott WG و Cowtan K. از ویژگی ها و توسعه Coot. Crystalogr Acta Crystalogr D Biol Crystalogr. 2010؛ 66: 486-501. pmid: 20383002
  85. 85.              Wang RY، Song Y، Barad BA، Cheng Y، Fraser JS و DiMaio F. ساختار خودکار پالایش مجامع ماکرومولکولی از نقشه های cryo-EM با استفاده از روزتا – سایپرز ، باشگاه دانش الیف 2016؛ pii: e17219. pmid: 27669148
  86. 86.              Adams PD، Afonine PV، Bunkóczi G، Chen VB، Davis IW، Echols N، et al. PhENIX: یک سیستم جامع مبتنی بر پایتون برای محلول ساختار ماکرومولکولی. کریستا آکتا 2010؛ D66: 213-221.
  87. 87.              چن VB ، آرندال WB 3rd ، Headd JJ ، Keedy DA ، Immormino RM ، Kapral GJ و همکاران . MolProbity: اعتبارسنجی ساختار همه اتم برای بلورنگاری ماکرومولکولی – سایپرز ، باشگاه دانش Crystalogr Acta Crystalogr D Biol Crystalogr. 2010؛ 66 (پایتخت 1): 12–21. pmid: 20057044
  88. 88.              باراد BA ، Echols N ، Wang RY ، Cheng Y ، DiMaio F ، Adams PD و Fraser JS . EMRinger: مدل زنجیره ای به کارگردانی سمت راست و اعتبار نقشه برای میکروسکوپ سه بعدی کریو الکترون. روش های Nat. 2015؛ 12 ، 943-946. pmid: 26280328
  89. 89.              Lütteke T ، von der Lieth CW. pdb-care (PDB بررسی کربوهیدرات REsidue): برنامه ای برای پشتیبانی از حاشیه نویسی از ساختارهای کربوهیدرات پیچیده در پرونده های PDB. BMC Bioinformatics 2004، 5: 69. pmid: 15180909

                   

      

    

     

٪٪ مورد_read_more_button ٪٪